Reactivos extracción ADN soluciones Bento HS-KIT. Caja 400 ensayos

Descripción

El kit de extracción de ADN HotSHOT proporciona un método de lisis alcalina rápido, económico y fiable para extraer ADN de calidad para PCR de una amplia gama de tejidos ricos en ADN. Entre los tejidos objetivo recomendados se incluyen tejidos animales, desde mamíferos hasta peces e invertebrados. Este protocolo también se ha utilizado con éxito para extraer ADN de hongos, plantas y bacterias, aunque algunas muestras pueden presentar mayores dificultades debido a la presencia de inhibidores de la PCR.

El kit utiliza una solución alcalina diluida que se calienta con la muestra en un termociclador (como Bento Lab) para lisar (descomponer) las células y liberar y desnaturalizar el ADN. Esta solución se neutraliza con una solución tampón de pH para reducir el pH y estabilizar el ADN liberado. El protocolo consta de un sencillo proceso de dos pasos de lisis celular y neutralización, que dura entre 10 y 30 minutos (según el tipo de muestra) una vez colocadas las muestras en los tubos. El formato de un solo tubo minimiza la manipulación, reduciendo la posible contaminación y la pérdida de ADN, y permite aumentar fácilmente el tamaño de las muestras según sea necesario.

Las extracciones por lisis alcalina son ideales para tejidos ricos en ADN con bajo contenido de sustancias inhibidoras de la PCR. Sus principales ventajas son su bajo coste por muestra, su facilidad de uso y su escalabilidad, desde una sola muestra hasta cientos. Por ello, se utilizan ampliamente en aplicaciones que van desde la genotipificación rutinaria hasta la detección de patógenos y la identificación genética mediante códigos de barras de ADN. No son adecuadas para muestras con altas concentraciones de compuestos inhibidores de la PCR ni para aplicaciones que requieran la extracción de ADN total, ADN no fragmentado o ADN de doble cadena.

Nuestro kit de extracción de ADN HotSHOT contiene una fórmula ligeramente modificada para prolongar la vida útil del producto.

Recomendaciones de aplicación

• Para su uso con una amplia gama de tejidos animales, así como con algunos tejidos vegetales, fúngicos y de plantas.

La lisis alcalina HotSHOT se ha utilizado para extraer ADN de tejidos de mamíferos, aves y peces; de invertebrados, parásitos animales y sus infusiones sanguíneas, así como de huevos de zooplancton. También se ha empleado para extraer ADN de hojas jóvenes de plantas, polen, cultivos líquidos y en agar de hongos, cuerpos fructíferos fúngicos diminutos y patógenos fúngicos en tejido vegetal.

• Un protocolo sencillo para extracciones rápidas, adecuado para un rendimiento de bajo a alto.

El ADN se puede extraer de forma eficiente en 10-30 minutos utilizando un solo tubo de PCR de 0,2 ml por muestra. Su mínima manipulación permite aumentar el volumen de las reacciones, desde unas pocas extracciones hasta cientos al día.

• Una solución de bajo costo para proyectos con presupuestos reducidos pero muestras de gran tamaño.

Las extracciones mediante lisis alcalina permiten extraer ADN a una fracción del coste de otros métodos de extracción, lo que supone un ahorro que se puede destinar a reactivos más caros.

• Mucho más seguro que la mayoría de los reactivos de extracción de ADN.

La solución de lisis alcalina HotSHOT es muy diluida (25 mM, o 0,1 % p/v) y, según las normativas y clasificaciones armonizadas de la UE y de la UE, no se considera irritante ni peligrosa. Además, las extracciones no requieren el uso de etanol. Por lo tanto, es considerablemente más segura que muchos otros métodos de extracción de ADN que utilizan sales de guanidinio o cloroformo.

• No apto para extraer grandes cantidades de ADN no fragmentado de alta calidad.

El método de lisis alcalina HotSHOT no es adecuado para aplicaciones que requieren la extracción de grandes cantidades de ADN no fragmentado de alta calidad. Es probable que los geles de electroforesis del ADN genómico extraído no muestren rastros o solo presenten una tenue mancha de ADN y ARN fragmentados, debido a las pequeñas cantidades de ADN extraído. Sin embargo, esto no afectará los resultados de la PCR.

Composición del reactivo

Solución de lisis : NaOH 25 mM, pH 12.

Tampón neutralizante : 100 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8.

La formulación se ha modificado ligeramente con respecto a la composición original del reactivo HotSHOT descrita por Truett et al. (2000), que utilizaba 25 mM de NaOH y 0,5 mM de EDTA para el tampón de lisis alcalina, y 100 mM de Tris-HCl para el tampón de neutralización. Esta modificación debería prolongar la vida útil del tampón de neutralización sin afectar notablemente su rendimiento.

Almacenamiento y estabilidad

Conservar de forma rutinaria a temperatura ambiente.

La exposición de la solución de lisis alcalina al aire disminuirá gradualmente su pH y la eficacia de este reactivo con el tiempo. El almacenamiento temporal durante un máximo de 6 meses a temperatura ambiente debería tener efectos perjudiciales mínimos si los recipientes y las bolsas se sellan correctamente. 

Para un almacenamiento a largo plazo, compruebe los niveles de pH antes de usar la solución de lisis alcalina.

Condiciones de envío

Se envía a temperatura ambiente.

Advertencias y precauciones de seguridad

Este producto y sus componentes no se consideran peligrosos en las concentraciones indicadas. La solución de lisis alcalina contiene 0,1 % de NaOH (25 mM, pH 12), lo que está por debajo del umbral considerado como irritante según la clasificación del GHS (de acuerdo con la normativa de la UE y la normativa del Reino Unido).

Sin embargo, como con todos los reactivos científicos, este producto debe manipularse y almacenarse con cuidado, siguiendo las normas de higiene. Use guantes. Evite el contacto con la piel y los ojos. En caso de contacto con la piel o los ojos, lave inmediatamente con agua. Manténgase fuera del alcance de los niños.

Protocolo de inicio rápido

Use guantes, equipos estériles y siga prácticas de trabajo estériles.

1. Elabore una lista numerada de las muestras y etiquete un tubo de PCR por cada muestra con el número de muestra correspondiente utilizando un rotulador permanente de punta fina.
2. Coloque 75 µL de solución de lisis alcalina en un tubo de PCR de 0,2 mL por muestra.
3. Tomar una submuestra de 1–2 mm³ ^de tejido y transferirla a cada tubo, asegurándose de que quede sumergida en la solución de lisis alcalina. Añadir un exceso de muestra puede provocar que la extracción o la PCR fallen.
4. Coloque los tubos en un termociclador e incúbelos a 95 °C durante 10-30 minutos (dependiendo del tipo de muestra) utilizando el programa Heat Block.
5. Añada 75 µL de tampón neutralizante a cada tubo de 0,2 mL.
6. Utilice entre 1 y 4 µL de extracto como fuente de ADN molde en una reacción de PCR. Los extractos de muchos tipos de tejido (por ejemplo, plantas, hongos, invertebrados, plumas, sangre) pueden beneficiarse de una dilución de 10 a 100 veces para diluir los inhibidores de la PCR antes de utilizarlos como ADN molde.
7. Guarde los tubos de muestra en una caja de 0,2 ml o en una bolsa pequeña, claramente etiquetada para evitar confusiones. Refrigérelos para su conservación a corto plazo o congélelos a –20 °C para su almacenamiento a largo plazo.